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Valutazione dell'integrità cromatinica dello spermatozoo mediante il test di frammentazione del DNA

Parere degli esperti |time pubblicato il
Valutazione dell'integrità cromatinica dello spermatozoo mediante il test di frammentazione del DNA

Gli articoli della sezione "Il parere degli esperti" riguardano alcuni fra gli argomenti più importanti e dibattuti delle rispettive aree cliniche. Dato il livello di approfondimento raggiunto, i testi possono contenere termini e concetti molto complessi. L’utilizzo del glossario potrà essere di aiuto nella comprensione di questi articoli e altri contenuti del sito, più divulgativi, contribuiranno a chiarire gli argomenti trattati.


Lo spermiogramma rappresenta l’esame di prima scelta nella valutazione dell’infertilità maschile. Tuttavia esso presenta delle limitazioni derivanti dalla scarsa quantità di informazioni di carattere funzionale riguardanti la qualità dei testicoli e del seme [1].

Fra i test biofunzionali, quello di maggior impiego nella pratica clinica è lo studio della frammentazione del DNA spermatico, che permette di valutare l’integrità cromatinica dello spermatozoo. Laddove non siano evidenti anomalie spermatiche che giustifichino l’infertilità maschile, tale test fornisce al clinico un ulteriore strumento nello studio dell’infertilità idiopatica (infertilità a causa non nota) o in casi selezionati [2].

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Sia nei processi di fecondazione naturale sia in seguito a tecniche di procreazione medicalmente assistita l’integrità del DNA dello spermatozoo riveste un ruolo fondamentale, in quanto contribuisce a un normale processo di fertilizzazione, a un normale sviluppo embrionale, al suo successivo impianto e all’instaurarsi di una gravidanza clinica.

Durante il processo di maturazione degli spermatozoi (spermatogenesi), il DNA è fisiologicamente soggetto a frammentazione, questi tagli sono poi riparati da alcuni enzimi chiamati topoisomerasi prima che gli spermatozoi fuoriescano nell’eiaculato. Laddove viene a mancare il corretto funzionamento della macchina di riparazione del DNA a livello del testicolo, si possono ritrovare nell’eiaculato spermatozoi frammentati e quindi danneggiati, non capaci di svolgere la loro funzione in maniera corretta.

Oltre a questi fattori intrinseci che comportano la presenza di spermatozoi a DNA frammentato nell’eiaculato, esistono fattori esterni che includono danni indotti da radio- e chemioterapia, varicocele, età del paziente, episodi di febbre alta, malattie infiammatorie acute e croniche, esposizione a temperature elevate, inquinamento dell’aria, fumo di sigaretta, stress ossidativo post-testicolare. Quest’ultimo è dovuto alla presenza nell’epididimo (ultimo tratto in cui lo spermatozoo passa per concludere la maturazione prima di fuoriuscire nell’eiaculato) di spermatozoi immaturi e altri tipi cellulari che producono radicali liberi e danneggiano il DNA dello spermatozoo in maturazione [3].

Numerosi studi hanno dimostrato che la concentrazione di spermatozoi frammentati presenti in un eiaculato correla con i parametri convenzionali del liquido seminale, anche se tale associazione non è così stretta, indicando che il danno al DNA spermatico potrebbe predire, in modo indipendente, il potenziale fecondante dello spermatozoo.

Esistono diverse metodiche utilizzate per la determinazione della frammentazione del DNA spermatico, le quattro principali sono: il Comet Assay, il TUNEL, il SCSA e Halo Test [4].

Il saggio Comet prevede l’inclusione degli spermatozoi in un gel, il DNA viene poi visualizzato grazie a un colorante specifico e le cellule danneggiate appaiono come una “cometa”, con una testa fluorescente e una coda la cui lunghezza e fluorescenza sono proporzionali al numero di “tagli” al DNA, più è frammentato il DNA, maggiore sarà la fluorescenza emessa dagli spermatozoi e più lunga sarà la coda della cometa. Tale metodica è molto rapida e sensibile e permette di valutare la frammentazione anche in campioni in cui vi è una concentrazione molto bassa di spermatozoi.

Il TUNEL test misura il danno reale e ha un alto valore predittivo nelle procedure di procreazione medicalmente assistita. Gli spermatozoi vengono fatti reagire con un enzima che aggiunge delle molecole fluorescenti al DNA nel punto in cui vi è la rottura, per cui è possibile visualizzare, mediante microscopio a fluorescenza o altri strumenti più sofisticati, la quantità di fluorescenza emessa e il numero di tagli sul DNA. Questo metodo è il più utilizzato nei laboratori di procreazione medicalmente assistita, in quanto è molto sensibile e può essere utilizzato anche in caso di liquidi seminali la cui concentrazione di spermatozoi è molto bassa.

Il SCSA prevede la determinazione dei tagli al DNA spermatico in modo indiretto, valutando cioè la suscettibilità della cromatina alla denaturazione (processo attraverso il quale la molecola di DNA che è composta da due catene di cromatina appaiate tra loro a formare una doppia elica, viene scomposta nelle due catene principali). Tale test permette di stimare la reale percentuale di DNA spermatico danneggiato, tuttavia è una metodica parecchio costosa per cui molti laboratori preferiscono utilizzare il TUNEL test, i cui risultati sono paragonabili a quelli del SCSA.

L’Halo Test determina la capacità della cromatina di formare degli aloni di dispersione in seguito alla denaturazione della doppia elica del DNA spermatico, permettendo di differenziare gli spermatozoi non frammentati (con alone) da quelli frammentati (senza alone) in modo indiretto. È un test molto semplice ma vi è una variabilità nella determinazione dovuta a differenze nella lettura dei risultati tra diversi operatori.

Alcuni studi hanno valutato la correlazione che c’è tra il danno al DNA (sfruttando le varie metodiche appena descritte) e i successi riproduttivi sia nelle gravidanze insorte spontaneamente sia in quelle generate in seguito a tecniche di procreazione medicalmente assistita [5,6]. È stato dimostrato che nella fecondazione naturale, nell’inseminazione intrauterina e nella FIVET (fecondazione in vitro e trasferimento in utero dell’embrione) il tasso di frammentazione al DNA è associato a un tasso di gravidanza più basso e che, laddove il tasso di DNA frammentato in soggetti sottoposti a FIVET è più basso, si ha un indice di bambini nati più elevato rispetto a soggetti con tasso di frammentazione spermatica maggiore. Per quanto riguarda la ICSI, invece, gli studi non hanno dato evidenze chiare di associazione tra la quantità del danno al DNA e gli esiti riproduttivi.

È stato inoltre dimostrato che le varie tecniche di rilevamento della frammentazione del DNA spermatico hanno impatti diversi, in particolare sembrerebbe che SCSA e Halo Test rispetto a TUNEL test e Comet test siano metodi meno predittivi degli esiti della fecondazione assistita (FIVET e ICSI), ma al contrario sembrano essere dei buoni predittori di gravidanza nel concepimento naturale e nelle inseminazioni intrauterine.

A oggi, le Società Scientifiche non raccomandano il test della frammentazione del DNA di routine nell’iter diagnostico del maschio infertile, in quanto la raccomandazione offre un grado di evidenza piuttosto basso a causa del tipo di studi che la supportano. Tuttavia in combinazione con lo spermiogramma può dare un quadro più comprensivo dell’infertilità maschile [7].

Il test quindi viene consigliato principalmente ai pazienti con varicocele di II e III grado con parametri normali del liquido seminale e in pazienti con varicocele di I grado con parametri seminali alterati o lievemente alterati. Nei pazienti con varicocele i livelli di DNA frammentato sono più elevati e si riducono dopo l’intervento chirurgico correttivo, dunque il test potrebbe aiutare il clinico a selezionare meglio i pazienti candidati all’intervento chirurgico.

Il test di frammentazione del DNA è indicato anche nei pazienti con infertilità idiopatica che intraprendono un percorso di procreazione medicalmente assistita, per selezionare la tecnica di fecondazione assistita più idonea alla coppia (FIVET, ICSI o inseminazione intrauterina), in quanto elevati livelli di frammentazione del DNA spermatico possono riscontrarsi anche in uomini con parametri seminali nella norma.

È inoltre consigliato effettuare il test in coppie che hanno subìto ripetuti aborti e ripetuti fallimenti in seguito a procedure di riproduzione assistita, ma anche nei casi in cui si sia osservata una cattiva qualità embrionale. È indicato inoltre agli uomini di età superiore ai 45 anni, in quanto con l’aumentare dell’età possono venir meno i meccanismi di riparazione del DNA e aumenta la produzione di radicali liberi dell’ossigeno e nei casi in cui sia necessario congelare il liquido seminale così da accertarsi che il prelievo congelato abbia livelli di frammentazione accettabili.

Anche gli stili di vita e i fattori di rischio ambientali come obesità, fumo di sigaretta ed esposizione a sostanze inquinanti ambientali o professionali favoriscono l’incremento dei tassi di DNA frammentato in quanto aumenta in generale lo stress ossidativo. Dunque in questi casi è consigliabile effettuare il test per la valutazione dell’integrità cromatinica. Alcuni dei fattori sopracitati sono reversibili (es. fumo di sigaretta, obesità), altri non sono removibili (es. età avanzata).

In conclusione, nei pazienti con elevata frammentazione del DNA spermatico è necessario ridurre i livelli di frammentazione valutando inizialmente se la causa è reversibile o irreversibile e successivamente adottare la strategia terapeutica o preventiva maggiormente indicata. In particolare si può procedere con la rimozione del varicocele, l’uso di antiossidanti e le modifiche degli stili di vita e scegliere la tecnica di PMA più adeguata.

Dott.ssa Stefania Luppi - IRCCS Burlo Garofolo, Trieste

Bibliografia

  1. van der Steeg JW, Steures P, Eijkemans MJ, et al.; Collaborative Effort for Clinical Evaluation in Reproductive Medicine Study Group. Role of semen analysis in subfertile couples. Fertil Steril 2011;95(3):1013-9.
  2. Shamsi MB, Imam SN, Dada R. Sperm DNA integrity assays: diagnostic and prognostic challenges and implications in management of infertility. J Assist Reprod Genet 2011;28(11):1073-85.
  3. Cissen M, Wely MV, Scholten I, et al. Measuring Sperm DNA Fragmentation and Clinical Outcomes of Medically Assisted Reproduction: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS One 2016;11(11):e0165125.
  4. Ribas-Maynou J, García-Peiró A, Fernández-Encinas A, et al. Comprehensive analysis of sperm DNA fragmentation by five different assays: TUNEL assay, SCSA, SCD test and alkaline and neutral Comet assay. Andrology 2013;1(5):715-22.
  5. Osman A, Alsomait H, Seshadri S, et al. The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis.Reprod Biomed Online 2015;30(2):120-7.
  6. Simon L, Zini A, Dyachenko A, et al. A systematic review and meta-analysis to determine the effect of sperm DNA damage on in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection outcome.Asian J Androl 2017;19(1):80-90.
  7. Cho CL, Agarwal A, Majzoub A, et al. Clinical utility of sperm DNA fragmentation testing: concise practice recommendations.Transl Androl Urol 2017;6(Suppl 4):S366-S373.