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Procedure di preparazione dello sperma nella inseminazione intrauterina

Parere degli esperti

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Procedure di preparazione dello sperma nella inseminazione intrauterina
Gli articoli della sezione “Il parere degli esperti” riguardano alcuni fra gli argomenti più importanti e dibattuti delle rispettive aree cliniche. Dato il livello di approfondimento raggiunto, i testi possono contenere termini e concetti molto complessi. L’utilizzo del glossario potrà essere di aiuto nella comprensione di questi articoli e altri contenuti del sito, più divulgativi, contribuiranno a chiarire gli argomenti trattati.

L’inseminazione intrauterina (IUI, intrauterine insemination) è una tecnica di procreazione medicalmente assistita di primo livello (ai sensi della legge 40/2004), oggi indicata per liquidi seminali con le seguenti caratteristiche di base:

1) presenza di spermatozoi con una morfologia normale maggiore o uguale al 4% secondo i criteri di Kruger [1]; e

2) con una conta di spermatozoi mobili totali, ottenuta dal prodotto del volume dell’eiaculato per la concentrazione spermatica e per la percentuale totale degli spermatozoi mobili, maggiore o uguale a 10 milioni [2].

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Gli spermatozoi presentano diversi tipi di motilità: 1) progressiva o lineare, che rappresenta un tipo di movimento che si compie lungo una traiettoria o linea precisa, che lo spermatozoo segue senza tornare indietro e può essere di due tipi, veloce o lenta; 2) non lineare, detta anche motilità agitatoria in loco o in situ, caratterizzata da un movimento sul posto non progressivo; 3) assente, caratterizzata da spermatozoi immobili. La conta totale degli spermatozoi mobili utilizzati per l’inseminazione, dopo la preparazione del campione di liquido seminale necessaria per un ragionevole successo della IUI, varia tra 1 milione e 5 milioni [3,4].

Le procedure per la preparazione del liquido seminale prevedono che la coppia non debba avere rapporti sessuali da un minimo di 2 a un massimo di 7 giorni prima della raccolta del liquido seminale per l’inseminazione, secondo le linee guida dell’Organizzazione Mondiale della Sanità pubblicate nel 2010 (OMS 2010). Il campione di liquido seminale, prodotto mediante masturbazione e raccolto in un contenitore sterile, è trattato sotto una cappa aspirante a flusso laminare per garantirne la sterilità. Dopo completa liquefazione a 37°C per 15 minuti, si determinano volume del campione di seme, conta, motilità e morfologia degli spermatozoi (OMS 2010). Il seme è preparato per la IUI in modo tale da recuperare la frazione di spermatozoi mobili presenti nel campione, mediante due tecniche principali: la prima è chiamata swim-up o migrazione ascendente e consente la separazione degli spermatozoi sulla base della loro motilità. Si utilizza di solito per campioni di liquido seminale con concentrazione spermatica maggiore o uguale a 20 milioni per millilitro e/o una motilità progressiva maggiore o uguale al 30% [5]. Il liquido seminale residuo dopo la determinazione dei parametri di base è trattato completamente, mettendo un millilitro dello stesso in una o più provette sterili. Il liquido seminale presente in ciascuna provetta è diluito, utilizzando terreno di coltura specifico per le preparazioni di liquido seminale che si trova in commercio, addizionato con albumina umana (proteina presente nel plasma sanguigno, prodotta dalle cellule epatiche), preriscaldato a 37°C [6] e miscelato con una pipetta sierologica sterile. Si centrifugano in seguito i campioni di seme diluito per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, si rimuove il liquido che sovrasta l’aggregato di cellule spermatiche presenti sul fondo della provetta e le cellule stesse vengono risospese nel terreno di coltura fresco e su tale volume, si stratifica lentamente con una pipetta sierologica dell’altro terreno. I campioni sono poi incubati a 37°C per un periodo da 30 a 60 minuti [6], mantenendo ciascuna provetta inclinata con un angolo di 45-60° per aumentare la superficie di scambio tra i due strati. In questo modo si separano gli spermatozoi dotati di motilità progressiva da quelli che presentano una motilità non progressiva o assente. Trascorso tale periodo, il terreno che sovrasta lo strato in cui le cellule sono state risospese, presente in ciascuna provetta, è prelevato delicatamente e le singole frazioni di terreno arricchite di spermatozoi mobili sono raccolte in un’unica provetta sterile e centrifugate per 10 minuti (se è presente un’unica frazione non si effettua alcuna centrifugazione). Si rimuove, poi, il liquido sovrastante e le cellule sono risospese in 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco. In ultimo si valuta la conta degli spermatozoi mobili totali recuperati, da utilizzare per la IUI.

La seconda tecnica usata è la centrifugazione in gradiente di densità discontinuo, che sfrutta l’alta densità degli spermatozoi e l’azione di filtro esercitata dalle particelle di silice colloidale contenute nei gradienti utilizzati per la separazione delle cellule mobili da quelle immobili e dalle cellule rotonde (es. leucociti, macrofagi, cellule spermatiche immature) o granuli gelatinosi, presenti nel liquido seminale. I gradienti sono preparati partendo da prodotti presenti in commercio opportunamente diluiti [7]. Si usa di solito per campioni di liquido seminale con una concentrazione spermatica minore di 20 milioni per millilitro e una motilità progressiva minore del 30% [5]. Il liquido seminale, rimasto dopo la determinazione dei parametri di base, è trattato completamente nel seguente modo: sul fondo di ciascuna provetta sterile, sono messi 0,5 millilitri del gradiente al 90% e si stratificano delicatamente su di esso 0,5 millilitri del gradiente al 45% e successivamente 1 millilitro di liquido seminale o la quantità disponibile residua. I campioni così ottenuti sono centrifugati per 20 minuti [6]. Dopo la centrifugazione, gli spermatozoi mobili e morfologicamente normali saranno maggiormente presenti nel gradiente al 90%, mentre i granuli gelatinosi, gli spermatozoi immobili, immaturi e altre cellule rotonde come i leucociti e i macrofagi, saranno trattenuti dal gradiente al 45%. I gradienti al 90% di ciascun campione sono trasferiti in un’unica provetta. Si aggiunge, quindi, il terreno di coltura fresco addizionato con albumina, preriscaldato a 37°C. I campioni così preparati sono successivamente centrifugati per 10 minuti. Il liquido che sovrasta l’aggregato di cellule spermatiche sul fondo della provetta viene infine rimosso e le cellule sono in seguito risospese in 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco. Si valuta a questo punto la conta degli spermatozoi mobili totali recuperati, da utilizzare per la IUI.

Andor David Crippa - Servizio di Fisiopatologia della Riproduzione Umana presso il Presidio Ospedaliero di Lugo (Ravenna)

Bibliografia

  1. Lee RK, Hou JW, Ho HY, et al. Sperm morphology analysis using strict criteria as a prognostic factor in intrauterine insemination. Int J Androl 2002;25(5):277-80.
  2. Van Voorhis BJ, Barnett M, Sparks AE, et al. Effect of the total motile sperm count on the efficacy and cost-effectiveness of intrauterine insemination and in vitro fertilization. Fertil Steril 2001;75(4):661-8.
  3. Horvath PM, Bohrer M, Shelden RM, Kemmann E. The relationship of sperm parameters to cycle fecundity in superovulated women undergoing intrauterine insemination. Fertil Steril 1989;52(2):288-94.
  4. Khalil MR, Rasmussen PE, Erb K, et al. Homologous intrauterine insemination. An evaluation of prognostic factors based on a review of 2473 cycles. Acta Obstet Gynecol Scand 2001;80(1):74-81.
  5. Burr RW, Siegberg R, Flaherty SP, et al. The influence of sperm morphology and the number of motile sperm inseminated on the outcome of intrauterine insemination combined with mild ovarian stimulation. Fertil Steril 1996;65(1):127-32.
  6. Karabinus DS, Gelety TJ. The impact of sperm morphology evaluated by strict criteria on intrauterine insemination success. Fertil Steril 1997;67(3):536-41.
  7. Henkel RR, Schill WB. Sperm preparation for ART. Reprod Biol Endocrinol 2003;1:108.

 

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