Quali parametri di cinetica embrionaria analizzare con il timelapse

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Quali parametri di cinetica embrionaria analizzare con il timelapse

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L’obiettivo finale della fecondazione in vitro (IVF) è selezionare l’embrione più competente per ottenere una gravidanza singola. Negli ultimi anni, la coltura di embrioni prolungata, con trasferimento allo stadio di blastocisti, è considerato un metodo utile per selezionare gli embrioni con alto potenziale di impianto e per ridurre le gravidanze multiple.

La coltura in vitro prolungata comporta dei rischi quali: potenziale aumento di disturbi epigenetici e parti pretermine. Inoltre per pazienti con pochi embrioni in coltura c’è il rischio di non avere un embrione di buona qualità da trasferire allo stadio di blastocisti, pertanto è importante poter identificare gli embrioni con più alto potenziale di sviluppo già nelle fasi di clivaggio embrionario [1].

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Negli ultimi decenni gli embriologi hanno valutato la qualità embrionaria attraverso un metodo di classificazione morfologica convenzionale e, da quando è stato approvato il sistema timelapse per uso clinico nel 2009, sono stati forniti maggiori dettagli sui processi morfocinetici di sviluppo degli embrioni. Utilizzando il sistema timelapse sono stati applicati parametri dinamici morfocinetici e morfologici per predire la formazione di blastocisti, il potenziale di impianto e un’eventuale aneuploidia [2,3].

La valutazione dello sviluppo embrionario avviene in tempi ben precisi [4-6]:

  • Fertilizzazione (Day 1): 17 ± 1 h (dopo inseminazione);
  • Singamia: 23 ± 1 h;
  • Primo clivaggio: 26 ± 1 h (dopo ICSI), 28 ± 1 h (dopo IVF);
  • Embrione (Day 2): 44 ± 1 h;
  • Embrione (Day 3): 68 ± 1 h;
  • Embrione (Day 4): 92 ± 2 h;
  • Embrione (Day 5): 116 ± 2 h.

Standardizzare i tempi di valutazione e classificazione embrionaria è un punto critico ma fondamentale per poter analizzare i dati di diversi laboratori in modo conforme e uniforme. L’introduzione del sistema timelapse ha migliorato questo aspetto. I dati di queste osservazioni possono essere annotati e analizzati utilizzando il software integrato al timelapse, al fine di sviluppare complessi algoritmi di selezione/deselezione degli embrioni [5].

L’introduzione del timelapse ha consentito sia un aumento del numero di osservazioni sia la valutazione dinamica dello sviluppo embrionario. Inoltre offre un ambiente di coltura ininterrotto, riducendo al minimo la manipolazione degli embrioni, rispetto alla valutazione morfologica tradizionale che richiede la rimozione fisica degli embrioni dall’incubatore, esponendoli a variazioni di temperatura, pH e livelli di ossigeno [5].

Wong et al. per la prima volta hanno riportato dati sulla registrazione dei tempi di clivaggio embrionari utilizzando un sistema timelapse al fine di prevedere il potenziale di sviluppo dell’embrione [7]. Da allora sono susseguiti numerosi studi sebbene abbiano molte limitazioni e i risultati vadano valutati con cautela. In primo luogo i parametri morfocinetici sono influenzati da diversi fattori quali: i protocolli di stimolazione, la popolazione di pazienti, le condizioni di coltura, la frammentazione del DNA negli spermatozoi. Inoltre l’efficacia clinica e il rapporto costo-efficacia del miglioramento dei risultati utilizzando i parametri morfocinetici per prevedere l’esito in IVF rimangono controversi.

Per ridurre le variabilità dell’interpretazione dei parametri ottenuti con il timelapse, alcuni ricercatori hanno utilizzato modelli di divisione piuttosto che timing di divisione, scoprendo che la scissione diretta (DC) e la scissione inversa (RC) esercitano effetti deleteri sul potenziale di impianto [8,9]. Recentemente, al posto del tempo di inseminazione, è stato proposto come tempo di inizio di riferimento il tempo di dissolvenza dei pronuclei (tPNF), al fine di eliminare l’errore associato al tempo di ingresso dello spermatozoo all’interno dell’ovocita.

Sono stati definiti otto comportamenti di divisione anomala tra i parametri dinamici morfologici:

  • embrioni con frammentazione >50% (FR): oltre il 50% di frammenti sparsi dopo la divisione;
  • embrioni con frammentazione 10-50% (F1): 10-50% di frammenti sparsi dopo la divisione;
  • embrioni con clivaggio diretto (DC): divisione diretta da una cellula a tre o più blastomeri;
  • embrioni con clivaggio inverso (RC): fusione dei blastomeri dopo la divisione;
  • embrioni con blastomeri irregolari (UB): il blastomero più grande è oltre il 20% più grande del blastomero più piccolo;
  • embrioni con un grande frammento (BF): dopo la divisione si sviluppa un grande frammento;
  • embrioni con divisione ritardata o arresto dello sviluppo (DDA): un blastomero ha una divisione ritardata o non è entrato nel ciclo cellulare successivo mentre gli altri vanno avanti nella divisione;
  • embrioni con movimenti del citoplasma irregolari (DCM): una serie di movimenti del citoplasma distorti.

Sono stati inoltre definiti i seguenti parametri morfocinetici di clivaggio:

  • tPNF: il tempo in cui entrambi i pronuclei si dissolvono;
  • t2: il tempo della divisione nello stadio a due cellule (completa la prima scissione);
  • t3: il tempo della divisione nello stadio a tre cellule;
  • t4: il tempo della divisione nello stadio a quattro cellule (completa la seconda scissione);
  • T2_PNF (t2-tPNF): durata del periodo a una cellula;
  • T3_PNF (t3-tPNF): durata del periodo dalla dissolvenza dei pronuclei allo stadio a tre cellule;
  • T4_PNF (t4-tPNF): durata del periodo dalla dissolvenza dei pronuclei allo stadio a quattro cellule;
  • cc2 (t3-t2): tempo del secondo ciclo cellulare (durata del periodo come due cellule);
  • s2 (t4-t3): tempo di sincronia del secondo ciclo cellulare (durata del periodo come tre cellule).

Gli embrioni con frammentazione >50%, DC, RC e divisione ritardata o arresto dello sviluppo (DDA) hanno mostrato un potenziale di sviluppo significativamente inferiore rispetto agli altri embrioni, inoltre queste anomalie hanno influito negativamente sulla formazione di blastocisti, come già precedentemente mostrato da Yang [10].

La frammentazione degli embrioni è un fattore cruciale nella valutazione morfologica convenzionale. Un alto grado di frammentazione porta alla perdita di organelli citoplasmatici come i mitocondri e induce ulteriormente effetti necrotici nei blastomeri circostanti che causano l’arresto dello sviluppo e un basso potenziale di sviluppo dell’embrione. La causa del DC e RC rimane sconosciuta. Si ritiene che la DC sia correlata alla formazione di fusi multipolari, che causano la segregazione anormale dei cromosomi durante la scissione. Inoltre gli embrioni con DC hanno una maggior probabilità di aneuploidie o numero di cromosomi anomalo. Il verificarsi di cambiamenti morfologici dannosi (DC, RC, FR, DDA) e la prevalenza di eventi morfocinetici dannosi non sono stati associati all’età della donna [1]. In uno studio è stato mostrato come l’età della donna non sia associata a RC ed è più frequentemente osservato nei protocolli con antagonisti del GnRH rispetto ai protocolli con agonisti del GnRH [4,5,9,10].

L’introduzione del timelapse ha consentito al gruppo di Coticchio [11] di tracciare una mappa approfondita degli eventi che si verificano durante la fecondazione che possono essere indicatori di qualità dell’embrione.

Hanno dimostrato di predire la qualità dell’embrione al giorno 3, gli intervalli di tempo di quattro eventi morfocinetici:

  • l’aspetto dell’alone citoplasmatico >> scomparsa;
  • aspetto dell’alone >> dissolvenza dei PN;
  • dissolvenza dei PN >> prima scissione (t2);
  • aspetto del PN maschile >> dissolvenza del PN maschile (tPNf).

Sono necessari ulteriori studi per valutare questi marcatori come predittori della qualità dell’embrione al quinto giorno e del risultato clinico.

Wong ha invece dimostrato che lo sviluppo di blastocisti può essere previsto con alta sensibilità (94%) e specificità (93%) in base ai parametri individuati seguendo l’embrione fino allo stadio di 4 cellule, ovvero l’intervallo di tempo tra la fine della prima mitosi e l’inizio della seconda (durata dello stadio a due cellule) e l’intervallo di tempo tra la seconda e la terza mitosi (durata dello stadio a tre cellule). Il tempo di clivaggio a 5 cellule e gli intervalli tra le due scissioni (t5, s2, cc2) hanno mostrato essere i parametri più predittivi di vitalità e impianto dell’embrione [7].

In uno studio sono stati definiti gli intervalli morfocinetici di clivaggio embrionario in cui si è ottenuto lo sviluppo fino allo stadio di blastocisti e l’impianto embrionario. Il t1 deve essere tra 18,4-30,9 h post-ICSI; t2 tra 21,4-34,8 h; t4 tra 33,1-57,2 h; t7 tra 46,1-82,5 h e t8 tra 46,4-97,8 h [4].

Il tC-tF tra 7,7-22,9 h (tF: tempo di comparsa di entrambi i pronuclei, tC: tempo di scomparsa dei pronuclei); s3 tra 0,7-30,8 h (differenza tra t8-t5) e cc3 tra 9,7-21 h (differenza tra t5-t3).

Questo studio ha definito due serie di parametri morfocinetici che sono [4]:

  • predittivi della capacità dell’embrione di continuare lo sviluppo in vitro fino allo stadio di blastocisti (t1, t2, t4, t7, t8, tC-tF, s3);
  • predittivi della competenza dell’embrione di impiantarsi (cc3).

Il monitoraggio mediante sistema timelapse permette di valutare l’embrione durante le varie attività dinamiche di sviluppo e di stabilire i parametri cinetici predittivi della competenza embrionale. Gli eventi di sviluppo aggiuntivi osservabili mediante timelapse, rispetto alla valutazione standard, sono utili per definire nuovi parametri di classificazione embrionaria quali: multinucleazione, divisione asincrona dei blastomeri e l’intera cinetica di sviluppo. Il fine è di selezionare al meglio l’embrione da trasferire ed escludere gli embrioni meno competenti [4].

La tecnologia timelapse è stata introdotta nella fecondazione in vitro solo nell’ultimo decennio, molto più tardi rispetto ad altri campi delle bioscienze, tuttavia ha portato a importanti cambiamenti nel modo di osservare e gestire gli embrioni. Le aspettative rispetto al timelapse erano alte, si sperava che l’osservazione dinamica di sviluppo offrisse una modalità più precisa e non invasiva per valutare la vitalità dell’embrione, con relative implicazioni per l’efficienza del trattamento. Molti studi hanno tentato di rispondere alla domanda se il timelapse apporti un beneficio clinico, senza però raggiungere un consenso infatti finora gli studi non sono riusciti a dimostrare in modo inequivocabile un miglioramento sostanziale del tasso di gravidanza e dei nati vivi.

Indipendentemente dall’impatto diretto sull’esito clinico, il timelapse conferisce però numerosi vantaggi che ne giustificano l’uso. La sua introduzione in un laboratorio di fecondazione assistita ha una molteplicità di implicazioni che richiedono competenze tecniche e gestionali. Sulla base delle tecnologie attuali, il timelapse offre probabilmente l’ambiente di coltura degli embrioni più sicuro e stabile. Il monitoraggio continuo degli embrioni ci ha permesso di identificare aspetti dello sviluppo precedentemente sconosciuti o non rilevabili, alcuni dei quali hanno un impatto clinico significativo. C’è inoltre la consapevolezza che aberrazioni cromosomiche possono influenzare la morfocinetica degli embrioni, ma non in misura tale da suggerire che il timelapse possa sostituire la PGT-A nell’identificazione degli embrioni euploidi.

Si spera che il sistema timelapse, in combinazione con gli sviluppi dell’intelligenza artificiale (IA) e approcci analitici non invasivi, possa evolversi sempre di più come modalità di selezione degli embrioni [5].

Bibliografia

  1. Yang S-H, Wu C-H, Chen Y-C, et al. Effect of morphokinetics and morphological dynamics of cleavage stage on embryo developmental potential: A time-lapse study. Taiwan J Obstet Gynecol 2018;57(1):76-82.
  2. Meseguer M, Herrero J, Tejera A, et al. The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum Reprod 2011;26(10):2658-71.
  3. Campbell A, Fishel S, Bowman N, et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online 2013;26(5):477-85.
  4. Chamayou S, Patrizio P, Storaci G, et al. The use of morphokinetic parameters to select all embryos with full capacity to implant. J Assist Reprod Genet 2013;30(5):703-10.
  5. ESHRE Working group on Time-lapse technology, Apter S, et al. Good practice recommendations for the use of time-lapse technology. Hum Reprod Open 2020 Mar 19;2020(2):hoaa008.
  6. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group Embryology. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod 2011;26(6):1270-83.
  7. Wong CC, Loewke KE, Bossert N, et al. Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat Biotechnol 2010;28(10):1115-21.
  8. Rubio I, Kuhlmann R, Agerholm I, et al. Limited implantation success of direct-cleaved human zygotes: a time-lapse study. Fertil Steril 2012;98(6):1458-63.
  9. Liu Y, Chapple V, Roberts P, Matson P. Prevalence, consequence, and significance of reverse cleavage by human embryos viewed with the use of the Embryoscope time-lapse video system. Fertil Steril 2014;102(5):1295-1300.e2.
  10. Yang ST, Shi Jx. Gong F, et al. Cleavage pattern predicts developmental potential of day 3 human embryos produced by IVF. Reprod Biomed Online 2015;30(6):625-34.
  11. Coticchio G, Mignini Renzini M, Novara PV, et al. Focused time-lapse analysis reveals novel aspects of human fertilization and suggests new parameters of embryo viability. Hum Reprod 2018;33(1):23-31.

 

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