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La ICSI con spermatozoi selezionati mediante annessina V

Parere degli esperti|timepubblicato il
La ICSI con spermatozoi selezionati mediante annessina V

Gli articoli della sezione "Il parere degli esperti" riguardano alcuni fra gli argomenti più importanti e dibattuti delle rispettive aree cliniche. Dato il livello di approfondimento raggiunto, i testi possono contenere termini e concetti molto complessi. L’utilizzo del glossario potrà essere di aiuto nella comprensione di questi articoli e altri contenuti del sito, più divulgativi, contribuiranno a chiarire gli argomenti trattati.


Negli ultimi decenni si è assistito a un tentativo di ottenere spermiogrammi sempre più precisi e riproducibili tra i vari laboratori. Questo miglioramento della qualità dell’esame ha però portato a un significativo e reale miglioramento clinico?

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Semplificando, lo scopo dello spermiogramma, in Procreazione Medicalmente Assistata (PMA), non è quello di descrivere semplicemente il numero, la morfologia e la velocità degli spermatozoi, ma quello di individuare lo spermatozoo più competente da usare nelle tecniche di PMA, cioè quello che possiede il migliore “potenziale di fertilità”. Quindi il vero scopo dello spermiogramma sarebbe quello di individuare uno o il pool di spermatozoi che permettano la fertilizzazione corretta dell’ovocita.

È quindi chiaro che un esame seminale standard non è in grado di dare una risposta adeguata alla misurazione della capacità fecondante di uno spermatozoo. Infatti, i tre parametri fondamentali analizzati da uno spermiogramma (numero, motilità, morfologia (“come sono fatti”) non sono in grado di misurare appunto la capacità fecondante degli spermatozoi [1,2]. È inoltre noto che mentre le anomalie del spermiogramma potrebbero far pensare a una spermatogenesi (“costruzione dello spermatozoo”) alterata, viceversa uno spermatozoo “normale” potrebbe anch’esso non avere una capacità normale di fertilizzazione. Lo spermatozoo è infatti una cellula molto complessa (non semplicemente “una testa e una coda ben costruite”) e potrebbe quindi essere alterato non nella morfologia ma nella sua funzione, soprattutto quando le sue componenti sono sottoposte a stress ambientali, di tipo biochimico o biofisico.

Inoltre la stessa morfologia o la motilità degli spermatozoi variano da eiaculato a eiaculato, e possono variare ampiamente anche all’interno di frazioni dello stesso eiaculato [3].

La separazione degli spermatozoi “buoni” da quelli “cattivi”

Tecniche per isolare spermatozoi di alta qualità si sono sviluppate fino dal 1993 quando R. Palermo rivoluzionò il mondo con la prima ICSI [4], cioè con l’iniezione di uno spermatozoo all’interno del citoplasma di un ovocita umano. Da quando è presente questa tecnica il numero e la morfologia degli spermatozoi tendono a essere sempre meno importanti, mentre l’individuazione di un unico spermatozoo di “alta capacità fecondante” sarebbe uno degli scopi fondamentali della PMA.

Tecniche di separazione degli spermatozoi

Molteplici sono le tecniche di selezione degli spermatozoi, per tecniche di PMA sia di I sia di II livello.

La selezione degli spermatozoi può essere effettuata su:

  • Motilità spontanea degli spermatozoi con una tecnica swim-up [5]
  • Motilità e morfologia dello spermatozoo attraverso centrifugazione in gradienti di densità [6]
  • Esame di “motile sperm organelle morphology” (IMSI) [7]
  • Selezione degli spermatozoi che attraversano passivamente microfluidi [8]
  • Seleziona basata sui cambiamenti di carica della superficie [9]
  • Selezione basata sugli spermatozoi non apoptotici (MACS) [10]
  • Selezione basata sulla maturità della membrana dello spermatozoo (PICSI) [11]

Le tecniche più avanzate di selezione degli spermatozoi

Selezione basata su Motile Sperm Organelle Morphology Examination (IMSI)

Nel 2002 Bartoov et al. descrivono per primi una tecnica chiamata “iniezione intracitoplasmatica di spermatozoo morfologicamente selezionato” detta IMSI. Questa tecnologia richiede un ingrandimento dello spermatozoo di circa 6000 volte e l’esame di alcuni organelli nel nucleo degli spermatozoi. È nell’insieme una tecnica complessa, che richiede molto tempo e apparecchiature molto costose. Secondo Bartoov la scelta di questi spermatozoi aumentava nettamente il numero di gravidanze in coppie con pregressa ICSI fallita [7].

I risultati di questa tecnica sono controversi. In uno studio [12] si evidenzia come la IMSI selezioni spermatozoi più adeguati con un aumento delle gravidanze e una riduzione dell’abortività. Una metanalisi Cochrane [13], però, non conferma questi dati specificando che non vi sono ancora indicazioni a un uso routinario di questa tecnica.

Selezione basata sulla maturità della membrana spermatozoaria (PICSI)

L’ovocita umano è circondato da acido ialuronico (HA) che agisce come selettore naturale: solo gli spermatozoi maturi che esprimono un recettore specifico per l’HA possono raggiungere e fertilizzare l’ovocita. Questi spermatozoi normalmente hanno una morfologia normale, un basso livello di frammentazione del DNA e bassa frequenza di apoptosi [11].

Un’ampia metanalisi [14] sembra non mostrare un aumento delle gravidanze, ma un miglioramento della morfologia delle blastocisti ottenute. Uno studio pubblicato su Lancet [15] inoltre indica l’inutilità della tecnica PICSI.

Selezione basata sugli spermatozoi non apoptotici (MACS)

Negli spermatozoi il DNA, contenuto nel nucleo (la loro “testa”) si trova in forma condensata. Possono però esservi alterazioni di questo DNA che, invece di essere correttamente condensato, comincia a sviluppare delle lesioni di una o di entrambe le catene del DNA, chiamate frammentazione. Questo fenomeno comincia quando si attiva la apoptosi, cioè la “morte programmata” dello spermatozoo. Lo spermatozoo apoptotico, però, presenta ancora una morfologia e una motilità “normali”, quindi non può essere riconosciuto all’esame microscopico standard.

LA MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) è una tecnica avanzata di selezione che si può usare per individuare lo spermatozoo che non mostri segni di apoptosi e, quindi, presumibilmente con un basso percentuale di danno di DNA. Poiché la disposizione della fosfatidilserina sulla membrana plasmatica è una precoce indicatore di apoptosi, la MACS usa delle palline paramagnetiche collegate all’annessina V che legano gli spermatozoi che mostrano la comparsa, sulla loro superficie, della fosfatidilserina [14].

La MACS sicuramente aumenta la morfologia degli spermatozoi selezionati e diminuisce il numero di quelli con DNA frammentato, quindi agisce da buon “selettore” degli spermatozoi dal DNA integro [17,18]. In una metanalisi [10] si evidenzia anche un lieve aumento delle gravidanze nel gruppo trattato con MACS, rispetto al controllo. Questi dati però non sono confermati da un ulteriore studio [15] che non evidenzia un aumento delle gravidanze nel gruppo trattato con MACS in confronto al gruppo non trattato.

Commento

Recentemente sono stati pubblicati molti studi che confrontano queste metodiche di selezione degli spermatozoi. Sembra oramai abbastanza accertato che la MACS sia in grado di selezionare spermatozoi di morfologia migliore e con un minore grado di frammentazione del DNA [16].

Ma questo si traduce anche in un maggior numero di gravidanze?

Hozaien [17] confronta 221 coppie con una frammentazione anomala del DNA degli spermatozoi. Queste coppie vengono divise in gruppi trattati con:

  • semplice centrifugazione
  • PICSI
  • MACS
  • ICSI con spermatozoi prelevati da testicolo.

Da questo studio risulta un aumento di formazione di blastocisti nel gruppo PICSI e MACS rispetto agli altri. Le gravidanze in questi due gruppi erano decisamente maggiori, ma non significativamente (per quanto ai limiti della significatività).

Uno studio prospettico di Alvarez Sedo [18] mostra come, in un programma di donazione di ovociti in pazienti con spermatozoi dal DNA alterato, vi sia un aumento del numero di blastocisti e delle gravidanze.

Anche in trattamenti di PMA di I livello, cioè nelle inseminazioni intrauterine (IUI) [19], la MACS è in grado di aumentare le gravidanze e ridurre la frequenza di aborto.

Conclusioni

Molta parte del futuro della PMA sarà dedicato alla selezione dello spermatozoo. Tutte queste tecniche stanno cercando appunto di individuare lo spermatozoo con migliori capacità di fertilizzazione. L’impressione è che la ricerca dello spermatozoo con minor frammentazione del DNA sia la strada più promettente. La MACS sembra quindi una delle tecniche più adatte ad aumentare le gravidanze e diminuire l’abortività. Allo stato attuale degli studi però questo non è stato ancora dimostrato, anche se una tendenza in questo senso sembra venire da molti studi più recenti.

Francesco Pastorella - Direttore Centro ZeroUno Procreazione, Centro di Medicina di Mestre

Bibliografia

  1. Collins JA, Wrixon W, Janes LS, Wilson EH. Treatment: independent pregnancy among infertile couples. N Engl J Med 1983;309:1201-6.
  2. Polansky FF, Lamb EJ. Do the results of semen analysis predict future fertility? A survival analysis study. Fertil Steril 1988;49:1059-65.
  3. Jeyendran RS, Holmgren WJ, Bielfeld P, Wentz AC. Fertilizing capacity of various population of spermatozoa within an ejaculate. J Assist Reprod Genet 1992;9:32-5.
  4. Palermo G, Joris H, Devroey P, van Steirteghem AC. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet 1992;340:17-8.
  5. Mahadevan M, Baker G. Assessment and preparation of semen for in vitro fertilization. In: C. Wood, A. Trounson (Eds.) Clinical in vitro fertilization. Springer-Verlag, Berlin, 1984:83-97.
  6. Allamaneni SSR, Agarwal A, Rama S, et al. Comparative study on density gradients and swim-up preparation techniques utilizing neat and cryopreserved spermatozoa. Asian J Androl 2005;7:86-92.
  7. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, et al. Real-time fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF-ICSI outcome. J Androl 2002;23:1-8.
  8. Rappa KL, Rodriguez HF, Hakkarainen GC, et al. Sperm processing for advanced reproductive technologies: where are we today? Biotechnol Adv 2016;34:578-87.
  9. Fleming S, Ilad R, Griffin AG, et al. Prospective controlled trial of an electrophoretic method of sperm preparation for assisted reproduction: comparison with density gradient centrifugation. Hum Reprod 2008;23:2646-2.
  10. Gil M, Sar-Shalom V, Melendez Sivira Y, et al. Sperm selection using magnetic activated cell sorting (MACS) in assisted reproduction: a systematic review and meta-analysis. J Assist Reprod Genet 2013;30:479-85.
  11. Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, et al. “Physiologic ICSI”: hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality. Fertil Steril 2010;93:598-604.
  12. Berkovitz A, Eltes F, Lederman H, et al. How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection. Reprod Biomed Online 2006;12:634-8.
  13. Teixeira DM, Barbosa MAP, Ferriani RA, et al. Regular (ICSI) versus ultra-high magnification (IMSI) sperm selection for assisted reproduction. Cochrane Database Syst Rev 2013;7:CD010167.
  14. Romany L, Garrido N, Motato Y, et al. Removal of annexin V-positive sperm cells for intracytoplasmic sperm injection in ovum donation cycles does not improve reproductive outcome: a controlled and randomized trial in unselected males. Fertil Steril 2014;102:1567-75.

15. Romany L, Garrido N, Cobo A, et al. Obstetric and perinatal outcome of babies born from sperm selected by MACS from a randomized controlled trial. J Assist Reprod Genet 2017;34:201-7.

16. Berteli TS, Da Broi MG, Martins WP, et al. Magnetic Activated Cell Sorting performed before double gradient centrifugation improve the recovery of good quality spermatozoa. Fertil Steril 2016;106(3):e290-e291.

17. Hozaien MM, Elqusi KM, Hassanen EM, et al. A comparison of reproductive outcome using different sperm selection techniques; density gradient, testicular sperm, PICSI, and MACS for ICSI patients with abnormal DNA fragmentation index. Fertil Steril 2018;110:e19-e20.

18. Alvarez Sedo C, Vic N, Uriondo H, et al. Impact of sperm DNA fragmentation reduction using MACS: comparative clinical outcomes on a shared oocyte donation program. Fertil Steril 2018;110(4):e291-e292.

19. Romany L, Rivera-Egea R, Meseguer M, et al. Magnetic activated sorting selection (MACS) of non-apoptotic sperm (NAS) improves ongoing pregnancy rates in homologous intrauterine insemination (IUI). Fertil Steril 2017;108(3):e128-e129.