Coltura prolungata degli embrioni fino allo stadio di blastocisti

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Coltura prolungata degli embrioni fino allo stadio di blastocisti

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Il processo evolutivo dell’embrione prevede diverse tappe: a partire dallo zigote (risultato della fecondazione dell’ovocita da parte dello spermatozoo), l’embrione subisce delle divisioni cellulari, che danno origine alle cellule (definite blastomeri) che compongono l’embrione. In un trattamento di fecondazione in vitro è possibile osservare e valutare in laboratorio le diverse fasi dello sviluppo embrionale, di seguito descritte.

I blastomeri che compongono un embrione fino al secondo e terzo giorno dall’inseminazione risultano distinguibili e in numero di 6-8; a seguito di ulteriori divisioni cellulari diventano progressivamente più piccoli di dimensioni, assumono contorni cellulari non ben delineati e formano, intorno al quarto giorno dall’inseminazione, un’unica massa compatta che prende il nome di morula. Intorno alla quinta-sesta giornata post-fecondazione, l’embrione inizia a generare una cavità piena di liquido (il blastocele) che spinge progressivamente le cellule a ridosso del guscio protettivo dell’embrione (definito zona pellucida).

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Ha inizio così il primo processo differenziativo delle cellule embrionarie che porterà successivamente alla formazione della blastocisti. Quest’ultima è costituita da due linee cellulari indipendenti dal punto di vista funzionale: una linea è costituita da cellule di tipo epiteliale, disposte sulla parete a costituire il trofoectoderma o trofoblasto da cui prenderanno origine gli annessi embrionali come il sacco vitellino e i villi coriali; l’altra linea cellulare è rappresentata da un agglomerato di cellule aderenti tra loro a formare la massa cellulare interna che darà vita al feto vero e proprio. A questo punto la blastocisti subisce un processo di espansione progressiva fino alla fuoriuscita dalla zona pellucida e all’acquisizione della capacità di adesione e impianto allo strato endometriale uterino [1].

La morfologia della blastocisti in laboratorio viene generalmente classificata prendendo in considerazione 3 caratteristiche: la grandezza e il grado di espansione (da 1 a 6 in senso crescente), la massa cellulare interna (A: numerose cellule addensate tra loro, B: alcune cellule raggruppate con minore densità, C: poche cellule, non si distingue in maniera netta la massa cellulare interna), e infine il trofoectoderma (A: molte cellule formano un epitelio monostratificato e molto ben organizzato, B: epitelio con densità cellulare inferiore, C: epitelio formato da poche cellule ancora disorganizzate) [2].

I vari passaggi descritti finra rappresentano il processo di formazione in vitro di una blastocisti che in maniera analoga avviene fisiologicamente all’interno dell’apparato riproduttivo femminile. In particolare, l’ovocita, una volta rilasciato dall’ovaio all’interno della tuba di Falloppio, viene raggiunto e fecondato da uno spermatozoo. Lo zigote che ne deriva va incontro a una serie di divisioni cellulari fino al quarto giorno dal concepimento, dando origine alla morula che entro il quinto giorno dalla fecondazione raggiunge la cavità uterina. Tra il quinto e il sesto giorno la morula evolve in blastocisti, la quale, grazie al rilascio di particolari enzimi, dà inizio all’impianto (o annidamento) nell’endometrio uterino.

In un programma di fecondazione assistita, il trasferimento embrionario può essere eseguito in seconda o terza giornata di sviluppo, oppure allo stadio di blastocisti, cioè in quinta o sesta giornata dalla fecondazione. Il momento migliore per eseguire il trasferimento dipende dalle caratteristiche morfologiche e di sviluppo degli embrioni, dal numero di embrioni ottenuti in un determinato ciclo di fecondazione assistita, dall’anamnesi e dalla storia clinica della coppia [3].

I processi biologici che portano alla formazione di un embrione sono numerosi, ma soprattutto estremamente delicati e complessi e non tutti gli embrioni sono capaci di eseguirli correttamente né in vivo né in vitro. Gli embrioni possono svilupparsi in ambiente extracorporeo fino allo stadio di blastocisti. Tuttavia, vi sono embrioni che possono andare incontro a un blocco dello sviluppo o a uno sviluppo di tipo anomalo, a causa di diversi fattori, come ad esempio la qualità degli ovociti e degli spermatozoi. Quelli che riescono a superare tutte le fasi di maturazione in vitro e arrivare a blastocisti possono definirsi i più competenti e quindi potenzialmente hanno maggiori probabilità di dare inizio a una gravidanza.

La qualità della coltura in vitro degli embrioni fino allo stadio di blastocisti è dunque di fondamentale importanza, in quanto consente di ricreare le condizioni fisico-chimiche ottimali che caratterizzano l’utero materno. In tal senso rivestono un ruolo fondamentale sia i mezzi di coltura sia le apparecchiature presenti nel laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Rispetto al passato, ora le tecniche di coltura si sono affinate e la maggior parte dei laboratori di embriologia fa uso di formulazioni chimiche di terreni altamente controllate ed efficaci nel favorire lo sviluppo dell’embrione fino allo stadio di blastocisti.

Attualmente esistono due principali metodiche di coltura in base alla tipologia di terreni utilizzati: sequenziale e a uso singolo [4]. La coltivazione di tipo sequenziale tende a soddisfare le diverse esigenze metaboliche dell’embrione, specifiche di ciascuna fase dello sviluppo, per cui la coltura avviene in una serie di terreni di composizione differenti, utilizzati in sequenza a partire dal momento della fecondazione fino alla quinta-sesta giornata e al trasferimento in cavità uterina. I terreni per la coltura a uso singolo invece vengono utilizzati per coltivare gli embrioni in un singolo e unico terreno dal giorno della fecondazione al giorno della formazione della blastocisti. Lo scopo di quest’ultima metodica di coltura è quello di assecondare il metabolismo dell’embrione conferendogli un terreno ricco e vario da cui può trarre in autonomia quanto necessario ai propri fabbisogni. Le due metodologie garantiscono un’equivalente efficacia nel permettere lo sviluppo degli embrioni in vitro e il conseguente impianto in utero.

Le apparecchiature attualmente presenti nei principali laboratori di procreazione medicalmente assistita sono dotate di tecnologie all’avanguardia che rendono gli incubatori degli strumenti compatti e dotati di accessori in grado di misurare in maniera continua e precisa la temperatura e i parametri micro-atmosferici, quali ossigeno e anidride carbonica, senza perturbare il microambiente e il progredire dello sviluppo embrionale.

Esiste una recente metodica di coltura embrionaria che si avvale della tecnologia time-lapse. Essa permette di ottenere ininterrottamente immagini dell’embrione dall’interno dell’incubatore grazie a un particolare microscopio che fotografa l’embrione e permette di osservare la sua evoluzione da zigote fino allo stadio di blastocisti. In questo modo non è necessario aprire l’incubatore ed estrarre l’embrione ogni qualvolta si desideri osservare la sua morfologia [5].

Un ruolo cruciale nella qualità della tecnica di coltura prolungata degli embrioni allo stadio di blastocisti in un laboratorio di procreazione medicalmente assistita è ricoperto dall’embriologo. Tale figura professionale infatti, grazie alla sua maturata esperienza e preparazione, deve garantire il massimo dell’efficienza nella coltura a blastocisti in base alle apparecchiature e ai mezzi di coltura che ha scelto per condurre il suo lavoro. Infatti, il miglioramento della formulazione chimica e il corretto e sapiente utilizzo dei terreni di coltura e delle apparecchiature impiegati in un laboratorio d’avanguardia, fanno in modo che a oggi una percentuale sempre maggiore di embrioni è in grado di crescere in coltura fino allo stadio di blastocisti.

La coltura fino allo stadio di blastocisti con il successivo trasferimento in utero dell’embrione a uno stadio tardivo comporta innumerevoli vantaggi. Innanzitutto, vi è la migliore sincronizzazione tra lo stadio di sviluppo embrionale e l’ambiente uterino, in quanto fisiologicamente l’embrione giunge nella cavità uterina allo stadio di blastocisti, di conseguenza trova le migliori condizioni ambientali e dovrà necessariamente impiantarsi nell’endometrio per sopravvivere.

La coltura avanzata garantisce, inoltre, una migliore selezione degli embrioni, permettendo di distinguere quelli evolutivi e potenzialmente competenti in quanto resistenti alla selezione naturale. A questo proposito vi sono degli studi che dimostrano che il prolungamento della coltura fino a stadi più tardivi dello sviluppo preimpianto forniscono probabilità di impianto e quindi di gravidanze cliniche statisticamente maggiori [6]. Tuttavia non vi sono dimostrazioni scientifiche che nei trattamenti di procreazione medicalmente assistita il trasferimento in utero di una blastocisti sia correlato a maggiori tassi di natalità rispetto al trasferimento di due embrioni in seconda o terza giornata dall’inseminazione. Infine, la coltura a blastocisti consente di valutare in maniera più accurata la vitalità embrionale e quindi di trasferire in utero un singolo embrione, riducendo il rischio d’insorgenza di gravidanze gemellari, che comportano notevoli rischi per la madre e i feti stessi.

È importante tenere presente che non sempre tutti gli embrioni in coltura riescono a raggiungere lo stadio di blastocisti, e che quindi la selezione embrionaria potrebbe concludersi in un mancato trasferimento embrionario, ponendo fine precocemente al trattamento di procreazione medicalmente assistita.

Dunque, un laboratorio di procreazione medicalmente assistita per poter garantire una adeguata coltura fino allo stadio di blastocisti deve essere dotato di strumentazioni all’avanguardia e terreni di coltura che forniscano condizioni ottimali per lo sviluppo in vitro, oltre a un’équipe medico-biologica altamente specializzata ed esperta.

La coltura prolungata a blastocisti è particolarmente indicata nelle coppie che hanno subito fallimenti ricorrenti dell’impianto, cioè pazienti con precedenti cicli di fecondazione in vitro dove non vi è stato l’annidamento dell’embrione in seguito al trasferimento in seconda o terza giornata dall’inseminazione, per cui non è mai insorta una gravidanza.

È inoltre indicata per le coppie che per motivi medici (ad es., diabete, ipertensione o altre malattie che potrebbero compromettere la salute della donna e del feto) o per scelta personale (ad es., non voler correre il rischio di ottenere una gravidanza gemellare) desiderano trasferire in cavità uterina un solo embrione, per cui l’elevata selettività della coltura a blastocisti permette una più accurata valutazione e selezione dell’embrione più competente da sottoporre al trasferimento.

Infine, per le coppie per cui è consigliata la diagnosi genetica preimpianto, la scelta della coltura a blastocisti è più affidabile, in quanto il materiale biologico su cui effettuare le analisi genetiche viene prelevato mediante una biopsia a livello del trofoblasto e consente di analizzare un numero maggiore di cellule rispetto alla biopsia su un embrione allo stadio di 8 cellule, da cui è possibile estrarre uno o al massimo due blastomeri. In tal modo, si evita di trasferire in utero embrioni con anomalie genetiche favorendo così il successo del trattamento di fecondazione assistita [7].

In conclusione, dunque, la coppia che ha deciso di intraprendere un percorso di procreazione medicalmente assistita deve far affidamento ai consigli del medico della riproduzione e dell’embriologo del Centro a cui si rivolge circa la scelta della coltura prolungata a blastocisti e del successivo trasferimento in utero in quinta/sesta giornata dalla fecondazione in vitro. Essi in base all’anamnesi clinica della coppia, al numero di embrioni ottenuti e alla qualità degli stessi in uno specifico trattamento forniranno indicazioni circa il giorno del trasferimento in utero degli embrioni.

Bibliografia

  1. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod 2011;26(6):1270-83.
  2. Gardner DK, Schoolcraft WB. Culture and transfer of human blastocysts. Curr Opin Obstet Gynecol 1999 Jun;11(3):307-11.
  3. Bortoletto P, Bakkensen J, Anchan RM. Embryo transfer: timing and techniques. Minerva Endocrinol 2018 Mar;43(1):57-68.
  4. Stimpfel M, Bacer-Kermavner L, Jancar N, Vrtacnik-Bokal E. T. The influence of the type of embryo culture media on the outcome of IVF/ICSI cycles. Taiwan J Obstet Gynecol 2020 Nov;59(6):848-54.
  5. Lundin K, Park H. Time-lapse technology for embryo culture and selection. Ups J Med Sci 2020 May;125(2):77-84.
  6. Glujovky D, Farquhar C, Quinteiro Retamar AM, et al. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database Syst Rev 2016 Jun 30;(6):CD002118.
  7. Sullivan-Pyke C, Dokras A. Preimplantation Genetic Screening and Preimplantation Genetic Diagnosis. Obstet Gynecol Clin North Am 2018 Mar;45(1):113-25.

 

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